التطبيقات الطبية لإنزيم الأسبارجينيز المنقى من بكتيريا الزائفة

الباحث

إسراء رحيم شلتاغ

المشرف

انتصار حسين علي

الجامعة

الجامعة التكنولوجية

الكلية / القسم

قسم العلوم التطبيقية / التقنيات الأحيائية

الشهادة

ماجستير

السنة

2023

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

L-asparaginase; Pseudomonas; Enzyme purification; Anticancer activity

تضمنت هذه الدراسة 37 عينة سريرية من بكتيريا p.aeruginosa تم عزلها من إصابات الحروق خلال الفترة من 1 من كانون الاول 2021 الى 1 من شباط 2022. من مستشفى اليرموك التعليمي في بغداد. من هذه العزلات السريرية, عشرون عزلة لبكتيريا p.aeruginosa تشخيص هذه العزلات من الناحية المظهرية والمجهرية والكيموحيوية, تم تاكيد تشخيص العزلات باستخدام جهاز VITEK2 . تم فحص قدرة هذه العزلات على L-Asparaginase cli} أظهرت النتائج أن أربعة عزلات من PL sti aeruginosa 45021212256 -.]بدرجات متفاوتة. كانت العزلة 23 هي الأكثر كفاءة في إنتاج الأنزيم في راشح الخام وكانت الفعالية 1.64 وحدة / مل. وهكذا تم اختيارالعزلة 73 لتحسين قابليتها على انتاج الانزيم. اختبرت درجة الحرارة والدالة الحامضية المثلى لانتاج الانزيم واظهرت النتائج ان افضل درجة حرارة لانتاج الانزيم كانت 9637 والدالة الحامضية المثلى هي 7.5 , في حاضنة هزازة بواقع 150 دورة ١ الدقيقة , لتصل الفعالية الانزيمية للانزيم الخام الى 2 وحدة / مل. تم إجراء تنقية L-Asparaginase الخام في خطوتين هما ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني بواسطة DEAE- Lil ja giles Ss Cellulose الترشيح الهلامي بواسطة 6-200 Sephadex كان النشاط النوعي للأنزيم المنقى 8.37 وحدة / ملجم بروتين ، مع استعادة إنزيم بنسبة 30.796. تم دراسة عدد من الخصائص الكيموحيوية للانزيم المنقى, واظهرت النتائج ان الوزن الجزيئي ل L- lise Asparaginase (120161. وأظهر LLG إنزيم الذروة عند الدالة الحامضية 68.0 مع GLE مثالي عند دالة الحموضة 7.0 - 8.0. بالإضافة إلى ذلك ¢ لوحظ أعلى نشاط عند 37 99 ، مما يشير إلى أن الإنزيم احتفظ بفعاليته الكاملة من 30 إلى 40 م9. وكما اظهرت النتائج ان اضافة الايونات HeCh, and MgCly بتركيز Mm 10 ادى الى انخفاض الفعالية الانزيمية للانزيم المنقى , في حين ظهرت زيادة ملحوظة في الفعالية الانزيمية عند اضافة مادة ]1 (11]. تمت دراسة سمية الانزيم النقي على تحلل كريات الدم الحمراء, واظهرت النتائج ان الاسبارجينيز المنقى يسبب سمية اقل من %5 لخلايا كريات pall الحمراء. تم تقييم الفعالية المضادة للاكسدة للانزيم المنقى باستخدام DPPH , اظهرت النتائج ان الاسبارجينيز المنقى لديه نشاط في ازالة الجذور الحرة تصل الى )70,940,92%( والذي يعتمد على زيادة تركيز الانزيم . تم استخدام اختبار MTT تقييم السمية الخلوية للأنزيم المنقى ضد خط خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 ، وأظهرت النتائج ان السمية الخلوية تعتمد على التركيز. وكان للانزيم تاثير سمي انتقائي ضد خط الخلايا السرطانية مع سمية خلوية قليلة تجاه الخلايا الطبيعية ، والمعاملة ب L-ASNasel] المنقى بعد 48 ساعة اظهر تثبيط نمو ATR وكان أكثر فعالية من تلك المعاملة لمدة 72 ساعة, كما وجد أن التركيز المثبط لنصف العدد من الخلايا (10050) هو 88 مايكرو غرام/مل و 95.7 مايكروجرام /مل لمدة 48 و 72 ساعة على التوالي.

This study included thirty-seven clinical specimens obtained for the isolation of P. aeruginosa, all from burns, from 1 December 2021 to 1 February 2022. All samples were sourced from Al-Yarmouk Hospital in Baghdad \ Iraq. From these clinical specimens, twenty bacterial isolates were successfully grown and recognized as P. aeruginosa, using morphological, microscopic, and biochemical assays, and the results were verified using the VITEK2 system. The L-asparaginase production capability of these isolates was analyzed. The results demonstrated that four P. aeruginosa isolates produced L-ASNaseII to varying degrees. The isolate P3 was the most effective at producing enzymatic activity of the crude filtrate was 1.64 U/mL. The P3 was thus chosen for enzyme optimization and purification. The optimal conditions to produce ASNase were tested. The optimum temperature was 37 oC and the pH value was 7.5, in a shaker incubator (150 rpm) for 48 hours. Under these circumstances, the enzyme activity of L- ASNaseII generated in culture media was 2 U/mL. The crude L-ASNaseII purification was carried out in two steps first, ion exchange chromatography by DEAE-Cellulose and gel filtration chromatography by Sephadex G-200. Asparaginase recovery was 30.7%, and its specific activity was found to be 8.17U/mg protein. purified L-ASNaseII was analyzed for a number of biochemical characterizations. ASNase has a molecular weight of approximately 120 KD and had been shown to activity at pH 8.0, with stability at pH 7.0 – 8.0. In addition, the highest activity was seen at 37 0C, indicating that the enzyme retained complete activity throughout a wide temperature range, from 30 to Adding HgCl2 and MgCl2, at concentrations 10mM, decreased enzyme activity. Also, EDTA has an observable rise when applied. The hemolytic toxicity of purified L-ASNase had been estimated, and the results showed that purified enzyme caused less hemolytic toxicity of RBCs (less than 5 %). The antioxidant potentials of purified L-ASNaseII were evaluated via scavenging ability by 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazine (DPPH), results demonstrated that purified ASNase has a very high free radical scavenging activity (70.9±0.92%) and that this antioxidant activity rises with concentration. The MTT assay was used to assess the cytotoxic potential of purified L-ASNaseII in vitro against the breast cancer MDA-MB-231 cell line, the enzyme showed higher activity, selectivity and anti-proliferative activity against cancerous cells along with tiny cytotoxicity toward normal cells, and treatment with purified L-ASNaseII after 48 hrs. significantly suppressed growth IR % and was more potent than that treatment for 72hrs. The results showed concentration-dependent cytotoxicity. The inhibitory concentration (IC50) was found to be 88 g mL-1 and 95.7 g mL-1 for 48 and 72 hrs., respectively.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب