التطبيقات الطبية لإنزيم L-Glutamate Oxidase المنتج والمنقى من بكتيريا Streptomyces spp

الباحث

دينا حازم عبد الحميد

المشرف

انتصار حسين علي

الجامعة

الجامعة التكنولوجية

الكلية / القسم

قسم العلوم التطبيقية / التقنيات الأحيائية

الشهادة

ماجستير

السنة

2022

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

إنزيم الكلوتاميت أوكسيديز; بكتيريا Streptomyces; تنقية الإنزيم; التطبيقات الطبية

تم الحصول على العزلات البكتيرية لبكتيريا Streptomyces المعزولة من التربة من جامعة بغداد AUIS العلوم / قسم التقنيات الأحيائية و زُرعت في وسط نخالة القمح الذي يستخدم لأنتاج أنزيم L-Glutamate Oxidase تم بعد ذلك أستخلاص الانزيم الخارج خلوي بأستخدام جهاز الطرد المركزي المبرد للحصول على الراشح و الذي يمثل الانزيم الخام. أختبرت درجة الحرارة المثلى و الرقم الهيدروجيني الأمثل لأنتاج الأنزيم و أظهرت النتائج أن أفضل درجة حرارة لأنتاج الأنزيم كانت 30 م؟ و الرقم الهيدروجيني الأمثل لأنتاج الأنزيم 0 _, ثم تمت تنقية الإنزيم بالترسيب بواسطة كبريتات الأمونيوم كخطوة تنقية أولى , الديلزة لأزالة الأملاح , كروماتوغرافيا التبادل الأيوني , و كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي كخطوة تنقية أخيرة, تم قياس الفعالية النوعية لكل خطوة من خطوات التنقية Gus أظهرت نتائج تنقية أنزيم L-Glutamate Oxidase بأستخدام كبريتات الأمونيوم أن الفعالية النوعية للأنزيم كانت 8.25 وحدة/ملغم بروتين و بنسبة تشبع 9060 ومعدل مرات تنقية 8 و حصيلة أنزيمية %20.8 , و أظهرت نتائج التنقية بأستخدام أنبوب الديلزة أن الفعالية النوعية كانت 9.5 وحدة/ملغم بروتين و معدل مرات تنقية 2 و حصيلة أنزيمية 2.6 9 , وأظهرت نتيجة التنقية باستخدام عمود التبادل الأيوني بالمبادل DEAE — Cellulose أن الفعالية النوعية كانت 25 وحدة/ملغم بروتين ومعدل مرات تنقية 5.2 و حصيلة أنزيمية 12.7 5% أظهرت نتائج التنقية بأستخدام الترشيح الهلامي 6200 Sephadex أن الفعالية النوعية كانت 56 وحدة/ملغم بروتين و معدل مرات تنقية 11.7 و حصيلة أنزيمية 904 , وكانت أفضل خطوة في عملية التنقية هي بأستخدام الترشيح الهلامي بسبب الحصول على فعالية نوعية عالية للإنزيم. تم اختبار درجة الحرارة المثلى والرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط وثبات الإنزيم , وأظهرت النتائج أن درجة الحرارة المثلى لنشاط الإنزيم كانت 37 م” ودرجات الحرارة المثلى GLA الإنزيم كانت )30-50( م ؟” Lats, كان الرقم الهيدروجيني الأمثل للنشاط 7.0 والرقم الهيدروجيني الأمثل لاستقرار الإنزيم (5.0-7.0). تم دراسة تأثير الأنزيم المستخلص و المنقى محلياً على دم الأنسان حيث تم جمع عينات دم من أشخاص أصحاء و درس تأثير مزج كميات متساوية من الأنزيم و بيروكسيد الهيدروجين US على حدة على جميع خلايا دم الأنسان و فحصت بأستخدام جهاز الهيماتولوجي و أظهرت النتائج عدم وجود تأثير سلبي كبير للأنزيم مقارنة ببيروكسيد الهيدروجين حيث بلغ عدد كريات الدم الحمراء 4 x 210 , و بلغ ase كريات الدم البيضاء x 7.5 °10 , و بلغ عدد الصفائح الدموية 293 x 910 كما تم أختبار قدرة الأنزيم على تحليل كريات الدم الحمراء حيث تم مزج نسب مختلفة من الأنزيم تراوحت بين ( 20 - 160 96 ) مع عالق كريات الدم الحمراء و تم أحتساب النسبة المئوية للتحلل حيث أظهرت النتائج أن النسب المئوية للتحلل كانت 9900.06 للنسبة الأولى و المتمثلة ب 20 % , 9700.09 للنسبة الثانية 9040 , و 9900.2 للنسبة الثالثة 9/80 ، و 42.6 للنسبة الأخيرة 0 كما تم فحص أختبار تأثير الأنزيم على وقت البروثرومبين ( تخثر الدم ) حيث أظهرت النتيجة أن وقت البروثرومبين للسيطرة و المتمثلة بالبلازما فقط كان 13.5 و وقت البروثرومبين بعد أضافة 20 مايكروليتر من الأنزيم مع البلازما كان 14.8 ثانية .

Bacterial isolates of Streptomyces bacteria isolated from soil were obtained from Baghdad University - College of Science / Department of Biotechnology and were grown in wheat bran medium that is used to produce L-Glutamate Oxidase enzyme. The extracellular enzyme was then extracted using a cooling centrifugation process to obtain the filtrate that represents the crude enzyme. Then the optimum temperature and pH for enzyme production were tested and the results showed that the best temperature for enzyme production was 30°C and the optimum pH for enzyme production was 7.0. The enzyme purification processes were carried out, which included precipitation with ammonium sulfate as a preliminary purification step, followed by dialysis to remove the salts. After that, ion-exchange chromatography and gel filtration were used to complete the purification process, and the enzyme activity was determined for each purification step. The results of purification of L- Glutamate Oxidase enzyme from Streptomyces using ammonium sulfate showed that the specific activity was 8.25 units per milligram protein with a saturation ratio of 60%, with 1.8 purification times and enzymatic yield 20.8%, and the results of purification using dialysis tube showed that the specific activity was 9.5 units per milligram protein with 2 purification times and enzymatic yield 2.6%. and the result of purification using DEAE - cellulose ion column showed that the specific activity was 25 units per milligram protein with 5.2 purification times and enzymatic yield of 12.7%, the results of purification using gel filtration using Sephadex G200 showed that the specific activity was 56 units per milligram protein with 11.7 purification times and enzymatic yield 4%, which was the best step in the purification process due to high enzyme’s specific activity. The optimum temperature and pH for the enzyme’s activity and stability were tested. The results showed that the optimum temperature for the enzyme’s activity was 37 °C and the optimum temperatures for the stability of the enzyme were (30 - 50) °C, while the optimum pH for the activity was 7.0 and the optimum pH for the enzyme stability was (5.0-7.0). The effect of the locally extracted and purified enzyme on human blood was studied, where blood samples were collected from healthy people, and the effect of mixing equal amounts of the enzyme and hydrogen peroxide separately on all human blood cells was studied, and they were examined using an Auto Hematology analyzer, and the results showed There was no significant negative effect of the enzyme compared to hydrogen peroxide, where the number of red blood cells was 4 x 10ˆ12, the number of white blood cells was 7.5 x 10ˆ9, and the number of platelets was 293 x 10ˆ9. It was also tested whether the enzyme was working on the hemolysis of red blood cells, where different percentages of the enzyme were mixed, ranging between (20-160%) with suspended red blood cells, and the percentage of hemolysis was calculated, where the results showed that the percentage of degradation was 0.06% of the first percentage represented by 20%, 0.09% for the second percentage 40%, 0.2% for the third percentage 80%, and 2.6% for the last percentage 160%. The enzyme effect on prothrombin time (blood clotting) was also examined. The result showed that the prothrombin time for control, which is only plasma, was 13.5 seconds, and the prothrombin time after adding 20 microliters of the enzyme with plasma was 14.8 seconds.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب