دراسة جزيئية لانتشار جينات الكاربينيمايز في العزلات السريرية للزائفة الزنجارية في العراق

الباحث

مروة غالب علي العامري

المشرف

سوسن محمد كريم - زهراء عبد المنعم عبد الهادي

الجامعة

الجامعة التكنولوجية

الكلية / القسم

قسم العلوم التطبيقية / العلوم التطبيقية / التقنيات الاحيائية

الشهادة

ماجستير

السنة

2024

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

Pseudomonas aeruginosa;Carbapenemase;Metallo-beta-lactamase;Gene expression

شملت الدراسة الحالية 155 عينة سريرية تم جمعها خلال الفترة الممتدة من أيلول إلى كانون الأول 2022. تم جمع العينات من مرضى ذوي مصادر سريرية مختلفة (الحروق، البول، الجروح، البلغم، الأذن، الدم)، ومن مختلف الأعمار، ومن كلا الجنسين. تم جمع العينات من ثلاثة مستشفيات في بغداد وهي مستشفى اليرموك التعليمي، مستشفى المحمودية، ومستشفى الطفل التعليمي المركزي. وباستخدام الفحوصات المظهرية والمجهرية للعزلات النامية على وسط تفاضلي وانتقائي، وكذلك المقاسات البيو كيميائية لتشخيص العزلات، تم التعرف على 55 عزلة على أنها بكتريا الزائفه الزنجارية. وكانت عدد العزلات حسب المصادر السريرية عبارة عن مسحات حروق 19 عزلة، مزرعة البول 12 عزلة ، مسحات الجروح 6 عزلة البلغم 11 عزلة، مسحات الأذن 5 عزلة، والدم 3 عزلة .وقد أظهرت هذه العينات اختلافات معنوية (P<0.01). تم إجراء الاختبارات البيو كيميائية بما في ذلك اختبار الأوكسديز واختبار الكاتاليز وكانت النتيجة 55 موجبة للأختبارين. تمت زراعة جميع عزلات P. aeruginosa على أوساط مختلفة ثم تم تشخيصها مظهريا وفقا للخصائص المجهرية والخصائص البيوكيميائية ومن ثم تم تأكيدها بنظام VITEK 2 المدمج. تم استخدام طريقة كيربي باور لجميع العزلات البكتيرية لمعرفة اختبار الحساسية للمضادات الحيوية لثمانية مضادات بكتيرية مختلفة تنتمي إلى فئات مختلفة: ليفوفلوكساسين (LEV)، إيميبينيم (IPM)، ميروبينيم (MEM)، أميكاسين (AK)، أستريونام (ATM). )، سيبروفلوكساسين (CIP)، بيبيراسيلين (PRL)، سيفيبيم (FEP). أظهرت النتائج الحالية أن من العزلات كانت إيجابية لمقاومة PRL وAK، ومقاومة لـ FEP، في حين كانت حساسة لـ CIP وIMP وحساسة لـ LEVO. تم اجراء فحص النمط الظاهري للإنزيمات المعدنية بيتا لاكتاماز (MBL) في اختبار تآزري القرص المشترك للعزلات المقاومة للإيميبينيم. تم إجراء PCR لتضخيم الجين MBL. تمت مقارنة مقاومة المضادات الحيوية للعزلات المنتجة ل MBL، من بكتريا الزائفة الزنجاريه المقاومة للإيميبينيم مع مقاومة العزلات غير المنتجة لـ MBL. تم اجراء الفحص المظهري للكشف الأولي عن وجود جينات الكاربابينماز نوعB في العزلات المقاومه للأميبنيم بأستخدام مزيج إيميبينيم وEDTA (إيثلين دايمين حمض رباعي الأسيتيك) تم بعد ذلك استخدام اختبار القرص وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن MβL. تم اختبار 20 من سلالات الزائفة الزنجارية المقاومة الإيميبينيم. أظهر اختبار القرص المركب للإيميبينيم EDTA نتائج إيجابية لـ 17 من 20 بكتيريا مقاومة للإيميبينيم تم اختبارها و20 من هذه الكائنات تحمل جينات MβL. تم إجراء التشخيص الجزيئي لـبكتريا الزائفه الزنجارية عن طريق استخلاص الحمض النووي لـ 25 عزلة وتضخيمها بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل للكشف عن جينات المقاومة VIM وIMP وSPM وGIM. أظهرت نتائج التعريف الجزيئي للزائفه الزنجارية أن الجينات المدروسة (VIM، SPM، GIM) وجدت في جميع العزلات العشرين، ولكن لم يتم العثور على جينات IMP في جميع العزلات العشرين. تم الكشف عن VIM وSPM وGIM وIMP بواسطة PCR التقليدي، وأظهرت النتائج وجود هذه الجينات في (20/25) من العزلات. تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) للتعبير الجيني. تحليل التعبير الجيني باستخدام تقنية RT-PCR استخدمت هذه الدراسة خمس وعشرين عزلة بكتيرية؛ ثلاثة منهم كانوا حساسين، واثنان كانا معتدلين، والعشرون الآخرون كانوا مقاومين، وتم تقييم التعبير الجيني لكل منهم. من أجل حساب دلتا Ct، تم تقييم التعبير الجيني لكل عزلة باستخدام التكرارات، وتم أخذ المتوسط ​​لكل عزلة، وتم استخدام العزلة الحساسة (المستخدمة ككونترول) للمضاد الحيوي Imipenem كمعاير. تشير النتائج إلى زيادة التعبير الجيني لجين، VIMوقلة التعبير الجيني لكل من GIM، SPMوIMP غير الموجودة في جميع العزلات. يتم تقديم تنظيم مضخات التدفق، وانخفاض نفاذية الغشاء الخارجي، واكتساب ميتالو بيتا لاكتاماز (MBL) كعوامل رئيسية تؤدي إلى مقاومة الكاربابينيم. هذه الجينات المهمة للمقاومة في الزائفة الزنجارية يتم تحفيزها عن طريق التغيرات الصبغية التي تعدل الغشاء نفاذية تدفق مضخة الإفراط في التعبير. بالإضافة إلى ذلك، يُظهر أن سلالات MβL مقاومة للأدوية المتعددة؛ ونتيجة لذلك، ينبغي الآن توجيه الجهود نحو الحد من التهديد الذي يهدد الصحة العامة من خلال منع انتشار مثل هذه المعزولات من خلال تدابير صارمة لمكافحة العدوى والحد من الخطر على الصحة العامة.

The present study included 155 clinical samples were collected through the period extending from September to December 2022. The samples were collected from both genders males and females,different ages patients from different clinical sources (Burn, Urine, Wound, Sputum, Ear, and Blood). Samples were collected from three hospitals in Baghdad including Al-Yarmouk Teaching Hospital, AL-Mahmmodiya Hospital, and Child’s Central Teaching Hospital. Depending on the characteristic examination, morphological of the colonies phenotypic and microscopic when grown in differential and selective media, as well as biochemical tests to diagnose isolates 55 isolates were identified as P. aeruginosa, and then confirmed by VITEK 2 compact system. Molecular diagnosis of P.aeruginosa was performed by extracting DNA for 25 isolates and amplified by polymerase chain reaction to detect 16s-rRNA. Molecular Identification the results showed that all samples are P. aeruginosa. the percentage of isolates according to clinical sources were burn swabs n=19, urine culture n=12, wound swabs n=6, sputum n=11, ear swabs n=5 and blood n=3 and these samples were showed significant differences (P≤0.01). The biochemical tests including the Oxidase test and catalase test the result of its 55. Kirby-Bauer method was used for all the bacterial isolates to find out the antibiotic susceptibility test for eight different antimicrobial agents belonging to different classes levofloxacin (LEV), imipenem (IPM), meropenem (MEM), amikacin (AK),asteronam(ATM), ciprofloxacin (CIP), piperacillin(PRL), cefepime(FEP). The current results show of isolates were resistant to PRL, AK, and resistant to FEP, while were sensitive to CIP, IMP, and sensitive to LEVO. Combined disk Synergy Test, the metallo-β-lactamases (MBL) phenotype of imipenem-resistant isolates was detected. PCR was performed to amplify gene MBL. The antibiotic resistance of MBL-producing isolates (VIM, SPM, GIM) of imipenem-resistant P.aeruginosa was compared with that of non-MBL-producing isolates. A standard and the imipenem and EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) combination The disc test and the polymerase chain reaction(PCR) were then used to detect MβL. 20 of the 55 P. aeruginosa strains tested positive for imipenem resistance. The imipenem EDTA combined disc test showed positive results for 17 of the 20 imipenem-resistant bacteria tested and 20 of these microorganisms carried MβL genes. Molecular diagnosis of P. aeruginosa was performed by extraction of DNA for 25 isolates and amplified by a polymerase chain reaction to detect VIM, IMP, SPM, and GIM resistance genes. VIM, SPM, GIM and IMP were detected by conventional PCR, and the results revealed that (20/25) of isolates had these genes present. Extraction of RNA was performed for gene expression. Analysis of gene expression by using RT-PCR This study employed twenty-Five bacterial isolates; three was sensitive, tow was moderate, the other 20 were resistant, and gene expression was assessed for each. In order to calculate the delta Ct, the gene expression of each isolate was assessed using duplicates, the average for each isolate was taken, and the isolate that was sensitive (used as a control) to Imipenem antibiotic was used as a calibrator. Results suggest that other undiscovered factors or pathways likely contribute to the upregulation of VIM and downregulation of GIM,SPM, IMP not founed in all isolates. The upregulation of efflux pumps, decreased outer membrane permeability, and acquired Metallo-beta-lactamases (MBL) are introduced as the main factors leading to carbapenem resistance These genes that are important for resistance in P. aeruginosa are induced by chromosomal changes that modify membrane permeability efflux pump overexpression. additionally shows that the MβL strains are multi-drug resistant; as a result, effort should now be directed toward reducing the threat to the public's health by preventing the spread of these isolates by tight infection control measures and the reduction of the danger to public health.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب