التحري الجزيئي للبروتينات المعزولة من خميرة Saccharomyces cerevisiae وتأثيرها التثبيطي على الفطريات والبكتريا الممرضة

الباحث

هبة هادي طه احمد الدباغ

المشرف

نجوى ابراهيم خليل البرهاوي - فاتن نوري عبد ملا عبد

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية التربية للعلوم الصرفة / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2022

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

الخميرة ; البروتينات ; التثبيط ; الفطريات والبكتريا الممرضة

تصّمنت الدراسة الحالية عزل 110 عزلة محلية من الخمائر من أنواع مختلفة من الفواكه والترب ومن أوراق البرتقال في مدينة الموصل ، وكانت أعلى نسبة مئوية للتردّد عائدة لخميرة Saccharomyces cerevisiae ، وشخّصت العُزلات بالاعتماد على الاختبارات المظهرية والمجهرية والكيموحيوية ، Sly تشخيص بعضها باستخدام نظام 2 Gl Vitek بالنسبة cal خميرة S.cerevisiae فأكّد تشخيصهما جزيئيا بوساطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) Polymerase Chain Reaction وياستعمال بوادىء متخصّصة بالجين Internal (/7S)Transcribed Spacer ولوحظ انفصال حزمة واحدة لكل Atje ويبحجم 550- 650 زوجاً قاعدياً وعند دراسة تتابع القواعد النتروجينية للحمض النووي DNA لوحظ وجود مواقع للتباين أو التغاير الوراثي عند مقارنتها بالجين 1715 في موقع NCBI الخاص بالعزلات المشخصة وأعطيتا الرّمز 011760491 5 ON168448 على التوالي ، كما Creed خميرة Aureobasidium 11115 جزيئيا وأعطيت الرَّمز 012614102.1 في بنك الجينات العالمي. كما تضمّنت الدراسة أيضاً عزل وتشخيص العديد من الفطريات من أنواع مختلفة من الترب في مدينة الموصل aby عددها 160 عزلة ، وكانت أعلى نسبة مئوية لتردّد الفطريات 7 تابعة aly Aspergillus niger bill نسبة مئوية للتردّد 90.6 OSI من sp. ،Fusarium oxysporum 8120101-15 وكانت ترية نبات الثّوم أعلى الترب بالتنوع الفطري ، إذ jd منها 22 غزلة ، aly ترية بالتنوع الفطري هي ترية الفراولة إذ بلغت عدد العزلات 2 عزلة. واستخدمت أيضاً في هذه الدراسة عزلات من بكتريا Agrobacterium وأجري لهم اختبار القدرة الإمراضية على أقراص الجزرء إذ لوحظ ظهور الأورام Crown gall على سطح أقراص الجزر لعزلتين من البكتريا المحلية Agrobacterium tumifaciens وظهور الجذور الشعرية Hairy roots على أقراص الجزر بعد إصابتها بالبكتريا القياسية Agrobacterium 625 .كما 75 ي للعزلتين المحليتين نوع A .tumifaciens تشخيص sie ، لتأكيد تشخيصهما باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ، ولوحظ ظهور حزم مفردة وغير مشتتة . وتم التضخيم باستخدام بواديء متخصّصة بالجين RNA + 165 ، وظهرت الحزم بحجم 1250 زوجاً قاعدياً لكلتا العزلتين . أجري اختبار المقاومة والحساسية للمضادات الحيوية لعزلتي خميرة S.cereviside ، وثلاث عزلات من بكتريا Agrobacterium قيد الدراسة ، ولوحظ أنّ الخمائر بعزلتيها مقاومة | ‘Ciprofloxacin ،Gentamicin ،Tetracycline ،Rifampicin للمضدات الحيوية وكانت حساسة تجاه المضادٌ الحيوي Cefotaximes Erythromycin ،Roxythrompicin ALY) أظهرت مقاومة للمضادات الحيوية JDM) وبالنسبة للبكتريا بعزلاتها a Nystatin Roxythrompicin ،Ciprofloxacin ،Erythromycin ،Tetracycline ،Rifampicin -Cefotaxime.s Gentamicin كانت حساسة تجاه المضادين Lin Nystatins تم إجراء اختبار التضادٌ التصالبي بين خميرة S.cerevisiae وأنواع من البكتريا المُشرضة aS, Agrobacterium النتيجة أنَّ 2 Asi S.cerevisiae تأثيراً في البكتريا من Ll .S.cerevisiae 1 من ناحية تأثير راشح خميرة cerevisiae .ى في الفطريات المُمرضة للنبات لوحظ أن النسبة المئوية للتّثبيط لراشح الخميرة 2 كان أعلى منها لراشح الخميرة 1 على الفطربات المُمْرضة الثلاثة Aspergillus niger.، Alternaria alternata و Fusarium 1 بنسب تثبيط 65.83، 64.03 و76.53 96 على التوالي ، وكان أعلى تأثيراً لكلا الراشحين في الفطر 1.50/0711. تبيّن من نتائج تجرية اختبار الصفيحة الدقيقة للراشح الخام لخميرة S.cerevisiae على Agrobacterium LYS: بطريقة التخافيف لتحديد التركيز المثبّط الأدنى Microplate MIC ،Assay أنه كلما ah تركيز الراشح زاد تثبيط بكتريا Agrobacterium بأنواعها الثلاثة ، وكان eal) 2 أكثر تاثيراً في البكتريا من راشح 1 S.cerevisiae ، وعند تقدير التركيز المثبط الأدنى MIC) Minimum Inhibitory Concentration ( لراشح خميرة 6 على Agrobacterium ، اتضح انه التركيز 6.25 مايكروغرام / مل هو التركيز المثبط الأدنى ¢ Gedy هذه الدراسة الأولى من نوعها في استخدام خميرة الخبز في تثبيط بكتردا Agrobacterium المُمرضة للنبات. تمّ الكشف عن المواد Akad! في راشح خميرة S.cerevisiae باستخدام جهاز الكروموتوغرافيا السائل ذي الأداء High Performance Liquid Chromatography lt!) (HPLC) واتخذت شكل منحنيات واضحة ، وقد تكون نوعاً من السموم Killer ALU) Toxins لذا أجري Las sll الكهربائي لاستخلاص وتشخيص البروتين على هلام بولي أكريل أمايد بطريقة Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) فظهرت حزم البروتين على الهلام وحدّد البروتين بالاعتماد على الوزن الجزيئي الذي قدر ب 5 كيلودالتون وتبيّن أنه من السموم القاتلة نوع K28 التي تفرزها خميرة 46 واستخدم في الدراسات اللاحقة، كما تم تأكيد هذا السم القاتل باستخدام HPLC بمقارنته بالعينة القياسية. bal عند استخدام البروتين المستخلص في تثبيط الفطريات المُمرضة للنبات ٠ فلوحظ أنّ النسبة المئوية للتثبيط تزداد كلما زاد التركيز المضاف إلى الوسط وأنّ السّمَّ المستخلص من S.cerevisiae 2 كان له تثبيطاً أعلى من 1 S.cerevisiae وأعلى تاثيراً له في الفطر F.solani وهذا يتطابق مع النتائج السابقة. وما يتعلّق بتجرية استخدام الصفيحة الدقيقة لتحديد التركيز المثبط الأدنى Gis (MIC) أنه التركيز 0.156 مايكروغرام / مل . وياستخدام المعلوماتية الحيوية Bioinformatics في تحليل النتائج تم التعرف على التركيب GAN و الشكل المتبلور للبروتين ثلاشي الأبعاد باستخدام برنامج Pymol analysis كما a3 تحديد تسلسل البروتين 28،! الذي بدوره يتكوّن من 2040 نيوكليوتيدة تشفر للأحماض الامينية المكونة للبروتين، ويعدها تم ترجمة تسلسل البروتين إلى الأحماض الأمينية التي تكوّنه . Cy

A The current study included isolation 110 local isolate of yeasts from different types of fruits, soil and orange leaves in Mosul. High percentage frequency of yeast Saccharomyces cerevisiae . The isolates were diagnosed depending on phenotypic, microscopic and biochemical tests. Moreover, the diagnosis of some of them was confirmed by using a Vitek system.The molecular diagnosis of the two isolates of S. cerevisiae was confirmed by using Polymerase Chain Reaction ( PCR) using specialized primers for the gene Internal Transcribed Spacer (ITS). It was observed that one band was separated for each isolate with a size of 550- 650 base pairs. When studying the sequence of the nitrogenous bases of DNA the presence variation or heterogeneity when compared with the gene ITS In the NCBI and you gave the code OM760491 and ON168448 respectively as well as molecular diagnosed of Aureobasidium pullulans and given the code OK614102.1 at the World Genebank. The study also included isolation and identification 160 fungi isolates from different types of soils in Mosul city and the highest percentage of fungi frequency was 26.7% for the fungus Aspergillus niger, and the lowest percentage frequency is 0.6% for each of the Bipolaris sp.,Fusarium oxysporum,The soil of garlic plant was the highest fungal diversity, were 22 isolates, and the lowest soil with fungal diversity was strawberry soil. So it is arrived two . Also,isolates of Agrobacterium were used in this study and, assay pathogenicity test of it on carrot discs by using an injury method, The tumors appeared on the surface of carrot discs of two isolates of local bacteria Agrobacterium tumifaciens , and the appearance of hairy roots on carrot discs after infection with standard Agrobacterium rhizogenes .In addition a molecular diagnosis for the two local isolates of A.tumifaciens B by using polymerase chain reaction (PCR), The appearance of single and non-dispersed bands .The amplification was using specific primers for gene 16s rRNA and the bands with a size of 1250 base pairs appeared for both isolates. The assay resistance and sensitivity for antibiotic were performed of the two isolates of S.cerevisiae and three isolates of Agrobacterium under study, it was noted that two yeasts isolates are resistant to antibiotics Rifampicin, Tetracycline, Gentamicin, Ciprofloxacin, Roxythrompicin, Erythromycin and Cefotaxime , and it was sensitive only for Nystatin antibiotic. The three isolates of Agrobacterium, it resistance to the following antibiotics such as Rifampicin,Tetracycline ,Erythromycin ,Ciprofloxacin, Roxythrompicin and Nystatin but sensetive with Gentamicin and Cefotaxime. The result of test a Cross-antagonism between S.cerevisiae with Agrobacterium was S.cerevisiae2 more effective on bacteria compared with S.cerevisiae 1 . On the other hand the test was effect filtrate of S. cerevisiae on plant pathogenic fungi it was observed that the percentage of inhibition of S.cerevisiae 2 is higher than S.cerevisiae 1 on the three pathogenic fungi Alternaria alternata, Aspergillus niger and Fusarium solani with inhibition ratio 65.83, 64.03 and 76.83% Respectively, and the highest effect of both filters was on F.solani. It was observed from the results of the microplate MIC assay of S.cerevisiae filtrate on Agrobacterium by dilution method to determine the minimum inhibitory concentration as the higher concentration of the filtrate, the greater inhibition three types of Agrobacterium , filtrate of S.cerevisiae 2 was more effective than filtrate S.cerevisiae 1 on bacteria. When estimating the minimum inhibitory concentration (MIC) of S.cerevisiae filtrate on Agrobacterium , it was found that 6.25 mg / ml is the minimum inhibitory concentration . This study is the first of its kind to use S.cerevisiae to inhibit Agrobacterium. The active substances was detection in the filtrate of S.cerevisiae by using a high-performance liquid chromatography HPLC It was shaped like clear curves, which might be a kind of killer toxins Therefore, electrophoresis was performed to extract and characterize the protein on a polyacrylamide gel by method SDS – PAGE,The protein bands appeared on the gel, and determined was k28 which secreted by S.cerevisiae depend on molecular weight, which was estimated at 5 kilodalton. It was used in subsequent studies, and the confirmed this toxin by using HPLC which compared with the standard sample. When using the extracted protein to inhibit plant pathogenic fungi, it was observed that the percentage of inhibition was increasde with the increase of concentration was added to the medium, and the toxin extracted from S.cerevisiae 2 a higher inhibition than S.cerevisiae 1 and also had a higher effect on F.solani and this is correspond with previous results. Regarding the experience of using the microplate MIC assay to determine the minimum inhibitory concentration(MIC). It was found that concentration 0.156 mg / ml. Using bioinformatics In the analysis of the results, were identified the atomic structure and the crystalline shape of the three-dimensional protein by Pymol analysis program and also determined the K28 protein sequence which consists of 2040 nucleotides that code for the amino acids that forming the protein, and then translated protein sequence into the amino acids that forming the protein . --- page 174 [OCR+] --- Molecular investigation of proteins isolated from Saccharomyces cerevisiae and their inhibitory effect on pathogenic fungi and bacteria. A Thesis Submitted By Hiba Hadi Taha Ahmed al-Dabbagh To The Council of College of Education for pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of Requirements For The Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Dr. Faten Noori Abed Mula Abed Assist. Prof. Dr. Najwa Ibrahim Khalil Al-Barhawee 2222 A.D 1444 A.H [OCR of page] Molecular investigation of proteins isolated from Saccharomyces cerevisiae and their inhibitory effect on pathogenic fungi and bacteria. A Thesis Submitted By Hiba Hadi Taha Ahmed al-Dabbagh To The Council of College of Education for pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of Requirements For The Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Assist. Prof. Dr. Najwa Ibrahim Khalil Dr. Faten Noori Abed Mula Al-Barhawee Abed 2022 A.D 1444 A.H --- page 175 [OCR+] --- University of Mosul College of Education for Pure Science Molecular investigation of proteins isolated from Saccharomyces cerevisiae and their inhibitory effect on pathogenic fungi and bacteria. Hiba Hadi Taha Ahmed al-Dabbagh Ph.D. thesis Biology Supervised by Assist. Prof. Dr. Faten Noori Abed Mula Abed Assist, Prof. Dr. Najwa Ibrahim Khalil Al-Barhawee 2222 A.D 1444 A.H [OCR of page] University of Mosul 0 College of Education al 7 for Pure Science ces c¢ Molecular investigation of proteins isolated from Saccharomyces cerevisiae and their inhibitory effect on pathogenic fungi and bacteria. Hiba Hadi Taha Ahmed al-Dabbagh Ph.D. thesis Biology Supervised by Assist, Prof. Assist. Prof. Dr. Najwa Ibrahim Khalil Dr. Faten Noori Abed Mula Al-Barhawee Abed 2022 A.D 1444 A.H

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب