إخلاف نبات البروكلي Brassica oleracea var. italica من بذوره الصناعية والكالس والجذور الشعرية المحولة بواسطة Agrobacterium rhizogenes ATCC 13332 مع عزل البروتوبلاست من أنسجته

الباحث

رغد محمد عبدالله المولى

المشرف

شفاء مهدي صالح - قتيبة شعيب النعمة

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية التربية للعلوم الصرفة / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2022

لغة الرسالة

عربي

الكلمات المفتاحية

البروكلي ; البذور الصناعية ; الجذور الشعرية ; البروتوبلاست

انتجت في الدراسة الحالية نباتات البروكلي Brassica oleracea var. italica من تمايز كالس أجزاء بادراتها (الجذورء السيقان والأوراق). فقد نجح كالس الاوراق والسيقان النامية على وسط موراشيج وسكوك (MS) الصلب المدعم ب 0.5 ملغم لتر * 6-Benzyl adenine (BA) و 0.2 ملغم Naphthalene Acetic- Acid (NAA) al وكالس الجذور النامي على وسط MS المدعم ب(0.5: 1.5، 2.0( ملغم لتر ' Thidiazuron (TDZ) في التكوين التلقائي للأفرع الخضرية بمرحلة واحدة بعدها تم تجذير هذه الأفرع بسهولة على وسط MSO الصلب الخالي من منظمات النمو وتأقلمت بنجاح. واستحدثت في هذه الدراسة الأجنة الجسمية Somatic embryos من كالس السيقان والجذور وكذلك من قطع السيقان والجذور عند زراعتها وإدامتها على وسط MS الصلب المدعم ب (0.4 و 0.5) ملغم لتر ' TDZ . وتشكلت من زراعة الأجنة المستأصلة على وسط MSO الصلب الخالي من منظمات النمو أفرعاً خضرية بلغ عددها 205 فرعاً جذرت Ley clas هذا مساراً مناسباً لإنتاج أعداد كبيرة من نباتات البروكلي. تمكنت الدراسة الحالية في أحد جوانبها المهمة من إنتاج البذور الصناعية synthetic 9 بإستخدام الأجنة الجسمية والقمم النامية. وأظهرت النتائج ان التركيز %2 الُجينات Sodium alginate a 5:3 5،all كان las LDL في اعطاء أعلى نسبة تحول 0015615100 (GL! ) للبذور من الأجنة الجسمية بلغت 60 % عند خزنها مدة 7 أيام في °4 سيليزية في حين أعطى تركيز %3 الُجينات الصوديوم اعلى نسبة تحول للبذور الحاوية على القمم النامية وصلت إلى 96 % عند الظروف نفسها ( مدة خزن 7 أيام في4” سيليزية) وقد اعتمد ll 5.8 %2 لجينات الصوديوم في التجارب لتغليف الأجنة الجسمية والقمم النامية كونه اعطى افضل شكل للبذور الصناعية بهيئة تراكيب كروية (Beads) بتداخله مع 12/ ملغم لتر كلوريد الكالسيوم المائي21120 CaCl. المستخدم عامل تصليب للبذور. sais واضحاً من نتائج الدراسة أنّ زيادة Bre الخزن لهذه البذور المصنعة انعكس سلباً على نسبة تحولها التي بلغت ادنى مستوياتها 28 و 52 96 عند خزنها مدة 60 Lag: في 4" سيليزية لكل من بذور الأجنة الجسمية والقمم النامية على الترتيب. من ناحية أخرى كان لزيادة درجة حرارة الخزن اثرسلبي بالغ في نسبة تحول البذور التي انعدمت( %0( Baie خزنها مدة 30 يوماً في حرارة الغرفة °25 سيليزية. كما ان تزويد حشوة البذور الصناعية للأجنة الجسمية ب 0 ملغم لتر | BA و 0.5 ملغم لتر 7 NAA رفع كفاءة انباتها لتصل 9668 عند خزنها Bae 7أيام في 4” سيليزية و %40 في درجة الخزن °25 سيليزية ويذات المدة. من النتائج الجديرة بالإهتمام المتحققة في هذه الدراسة، الحصول على نباتات البروكلي المحولة وراثياً بواسطة السلالة البربة Agrobacterium rhizogenes ATCC13332 و بلازميداتها (Root inducing plasmid) pRi — DNA بتقنيتي الحقن المباشر Direct 0 والزراعة Co- cultivationzalyll إذ بزغت الجذور الشعرية في مواقع التلقيح ومواقع غير ملقحة بعد 7 أيام من حقن الأوراق وبنسبة 9981.1 عند إستخدام المعلق البكتيري ذي الكثافة الضوئية 1.6 = Lain ، OD أظهرت نتائج الزراعة المرافقة للأوراق مع بلازميدات مع المعلق البكتيري توافقاً باستحثاث الجذور الشعرية بنسبة أعلى مما هي عليه بالحقن بالبكتريا إذ سجلت 85, . من النتائج البارزة التي حققتها هذه الدراسة أنّه أثناء إدامة الجذور الشعرية لمدة ASE أشهر على وسط MSO الصلب الخالي من منظمات النمو لوحظ زيادة اقطارها واكتسابها Ligh أخضراً ، Land Gly من مزارعها بدأت بالتضخم لتكوين كتل كبيرة من الكالس في وسط MS ووسط Woody Plant Medium (WP) المدعمين بتراكيز مختلفة من TDZ )60.3 0.5، 8 1.0) ملغم لتر AST منها على انفراد. وبإستمرار إدامتها على هذه الأوساط كونت أفرعاً خضرية Code بسهولة بعد 7 - 9 أيام من نفلها الوسط MSO ونجحت اقلمتها في مزيج التربة والبتموس. وأشارت الدلائل المظهرية لنباتات البروكلي والمتمثلة بقصرها وتغيير شكل أوراقها وتجعدها Gi هذه النباتات محولة Lily . وأيدت إختبارات البيولوجي الجزيئي حدوث التحول الوراثي فقد وجدت القراءات تفوقاً في تراكيز الحامض النووي في العينات المحولة Lily مقارنة بعينات المقارنة. كما بينت إختبارات التفاعل التسلسلي البولميرازي polymerase chain reaction(PCR) والترحيل الكهربائي لعينات الاحماض النووية المضخمة وباستعمال البادئات المتخصصة لجينات © rol المحمولة على قطعة DNA — 7 لبلازميد البكتريا إلى احتفاظ أنسجة نباتات البروكلي بهذه الجينات المسؤولة عن بزوغ الجذور الشعرية وظهورها في هذه النباتات. أمكن عزل البروتويلاست من النسيج المتوسط لأوراق نباتات البروكلي Brassica oleracea var. italica بإستخدام مجموعة من المحاليل الانزيمية لهضم الجدر الخلوية التي أظهرت تبايناً في كفاءة Spall وتفوق المحلول الانزيمي المتكون من 961.0 Cellulase R — 10 و %0.3 Pectinase وبوجود 0 من المانيتول مستغرقاً 16 ساعة الذي حقق ناتجاً بلغ 20 x 710 خلية مل ' بحيوية 9693 واتصف البروتويلاست بشكله الكروي وتباين توزيع البلاستيدات الخضراء فيه وتراوحت اقطاره بين 15 - 52 مايكروميتر. فضلاً عن ذلك عزل البروتوبلاست من الجذور الشعرية المحولة وراثياً و تفوق المحلول الانزيمي المتكون من 901.5 Cellulase YC و 900.1 23 - Pectolyase Y بوجود %13 مانتول مستغرقاً 8 ساعة وسجل ناتج البروتويلاست 1 X 710 خلية مل ' بحيوية 7676، وامتاز البروتويلاست المتحرر بشكله الكروي وتراوحت اقطاره 5 - 17.5 مايكروميتر. ولم تنجح جميع المحاولات المتعلقة بزراعة نوعي البروتوبلاست بطريقة الطمر في قطرات الاكاروز بإستخدام الوسطين MS 5 KM8p المحور.

A In the present study, broccoli, Brassica oleracea var. italica plants was produced from callus differentiation of seedling explants (root, stem, leaf). Shoots were formed spontaneously by one-step regeneration from stem callus grown on solidified Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 0.5 mg L-1 6-Benzyl adenine (BA) and 0.2 mg L-1 Naphthalene Acetic- Acid ( NAA) and root callus grown on MS medium supplemented with (0.5, 1.5 and 2.0) mg L-1 Thidiazuron (TDZ).These shoots easily rooted on solidified free MSO medium and acclimatized successfully. Somatic embryos were induced from stem’s and root’s callus, as well as from stem and root explants when cultured and maintained on MS medium supplemented with (0.4 and 0.5) mg L-1 TDZ. By culturing the excised embryos on solidified MSO medium, 205 shoots were formed and rooted successfully. This was considered a suitable path for the production of large numbers of broccoli plants. In one of its important aspects, the current study was able to produce synthetic seeds using somatic embryos and shoot tips. The results showed that the concentration of 2% sodium alginate was very suitable in giving highest conversion rate (germination) of seeds from somatic embryos, which reached 60% when stored for 7 days at 4°C, while 3% sodium alginate gave the highest conversion rate for seeds containing shoot tips (96%) under the same conditions (7 days storage period at 4°C). The concentration of 2% sodium alginate was adopted in the experiments to encapsulate the somatic embryos and the shoot tips, as it gave the best shape for the artificial seeds in the form of spherical structures (Beads) by interfering with 12/mg l-hydrated calcium chloride CaCl2. 2H2O used as a hardening agent for seeds. B It was clear, that increasing the storage period of these artificial seeds reflected negatively on the percentage of their conversion, which reached the lowest levels 28 and 52% when stored for 60 days at 4 °C for both somatic embryo seeds and shoot tops, respectively. On the other hand, the increase in the storage temperature had a significant negative effect on the rate of conversion (0%) when they were stored for 30 days at 25°C. In addition, providing artificial seed’s matrix with 1.2 mg L-1 BA and 0.5 mg L-1 NAA raised the germination efficiency to 68% when stored for 7 days at 4°C and 40% at 25°C for the same period. Interestingly, transgenic broccoli plants were achieved by the wild strain of Agrobacterium rhizogenes ATCC13332 and its pRi-DNA (Root inducing plasmid), utilizing direct injection and Co-cultivation techniques. Hairy roots emerged in inoculated and non-inoculated sites after 7 days of leaves injection with a percentage of 81.1% when using the bacterial suspension with a light density of OD = 1.6, while the results of co-cultivation the leaves with pRi-DNA showed an increase in the rate of hairy roots induction, which recorded 85%. One of the important results achieved, is that during the maintenance of hairy roots for three months on MSO medium their diameters increased and they acquired a green color. Moreover, large masses of callus were initiated from these hairy roots in both MS and Woody Plant Medium (WP) supplemented with different concentrations of TDZ (0.3, 0.5, 0.8, 1.0) mg L-1. Through continuing subculture in these media, shoots regenerated, which were rooted easily after 7-9 days in MSO medium, then successfully acclimatized in the mixture of soil and peat moss. The phenotypic evidence of broccoli plants, represented by their shortness, change in the shape and wrinkling of their leaves, indicated that these plants are genetically transformed. Molecular biology tests supported the occurrence of genetic transformation, as the results found higher DNA concentrations in the genetically transformed samples compared to the control. The polymerase chain reaction (PCR) tests and the electrophoresis of the amplified nucleic acid samples and using the specialized primers for the rol C genes carried on the T-DNA showed that the genetically transformed broccoli plants retain these genes which responsible for the appearance of hairy roots in these plants. Protoplasts were isolated from the mesophyll of broccoli plants, Brassica oleracea var. italica using groups of enzyme solutions which showed a variation in the efficiency of isolating protoplasts. The best enzyme solution was consisting of 1.0% Cellulase R-10 and 0.3% Pectinase and in the presence of 10% of manthol, taking 16 hours, which achieved a result of 20 × 105 cell ml-1 had a viability of 93%. The protoplast was spherical in shape and the distribution of chloroplasts varied in it, and its diameters ranged between 15-52 μm. Also, protoplasts were isolated from the genetically transformed hairy roots. Enzyme solution consisting of 1.5% YC Cellulase and 0.1% Y-23 Pectolyase in the presence of 13% mantol was superior. It took 18 hours, and the protoplast yield was 1 x 105 cells ml-1 with a viability of 76%. The protoplast was spherical in shape and its diameters ranged from 5- 17.5 μm. Unfortunatly, all attempts related to the culture of the two types of protoplasts by embedding in agarose droplets using KM8p and MS media were unsuccessful. --- page 181 [OCR+] --- University of Mosul College of Education for Pure Science Regeneration of Broccoli Plant Brassica oleracea var. italica from It's Artifical Seeds, Callus and Trasformed Hairy Roots via Agrobacteriaum rhizogenes ATCC 13332 with Isolation of Protoplast from It's Tissues Raghad Mohammed Abdulla Al-Mula Ph.D. Thesis Biology Supervised by Assist. Prof. Dr. Shifaa Mahdi Salih Assist. Prof. Dr. Qutaiba Shoaib Al-Neama 2022 A.D 1443 A.H [OCR of page] University of Mosul 2 College of Education SEES for Pure Science Srna oe Regeneration of Broccoli Plant Brassica oleracea var. italica from It's Artifical Seeds, Callus and Trasformed Hairy Roots via Agrobacteriaum rhizogenes ATCC 13332 with Isolation of Protoplast from It's Tissues Raghad Mohammed Abdulla Al-Mula Ph.D. Thesis Biology Supervised by Assist. Prof. Assist. Prof. Dr. Shifaa Mahdi Salih Dr. Qutaiba Shoaib Al-Neama 2022 A.D 1443 A.H --- page 182 [OCR+] --- Regeneration of Broccoli Plant Brassica oleracea var. italica from It's Artifical Seeds, Callus and Trasformed Hairy Roots via Agrobacteriaum rhizogenes ATCC 13332 with Isolation of Protoplast from It's Tissues A Thesis Submitted By Raghad Mohammed Abdulla Al-Mula To The Council of the College of Education for Pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Dr. Shifaa Mahdi Salih Assist. Prof. Dr. Qutaiba Shoaib Al-Neama 2022 A.D 1443 A.H [OCR of page] Regeneration of Broccoli Plant Brassica oleracea var. italica from It's Artifical Seeds, Callus and Trasformed Hairy Roots via Agrobacteriaum rhizogenes ATCC 13332 with Isolation of Protoplast from It's Tissues A Thesis Submitted By Raghad Mohammed Abdulla Al-Mula To The Council of the College of Education for Pure Science University of Mosul In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Ph.D. In Biology Supervised by Assist. Prof. Assist. Prof. Dr. Shifaa Mahdi Salih Dr. Qutaiba Shoaib Al-Neama 2022 A.D 1443 A.H

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب