تشخيص بعض البكتريا صعبة الإرضاء المعزولة من عينات سريرية باستخدام التقنيات الجزيئية

الباحث

أيمن محمد خليل حسوني

المشرف

هيام عادل ابراهيم الطائي - ريان مازن فيصل العبيدي

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

دكتوراه

السنة

2023

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

Fastidious Bacteria ; Molecular Diagnosis ; Clinical Specimens ; PCR

الخُلاصة تفشل العديد من مسببات الأمراض ASSN في امكانية عزلها على الأوساط الزرعية لعدة أسباب Le في ذلك تعاطي المضادات الحيوية من قبل المرضىء بطء نمو بعض مسببات الأمراضء انخفاض عدد مسببات الأمراض في العينة، أو الحاجة إلى عناصر غذائية وعوامل مساعدة خاصة. Lady لذلك، يتم تشخيص العينات بشكل خاطئ على أنها سلبية فيما قد تحمل بعض الميكروبات المسببة للأمراض. يعد تطوير استراتيجيات جديدة لتحديد البكتيريا Lage Ipoh لتوفير نظام صحي أفضل. هدفت هذه الدراسة إلى التشخيص المباشر لمسببات الأمراض البكتيرية من العينات السريرية عن طريق تضخيم الجين FRNA 165 ومن ثم تحديد تسلسله النيوكليوتيدي. تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها مع الطرق التقليدية المستخدمة في المستشفيات لتشخيص الميكرويات المسببة للأمراض وتحديد كفاءة الطرق الجزيئية مقارنة بالطرق التقليدية في تشخيص البكتيريا من العينات السريرية. لهذا السبب تم جمع 120 عينة من السائل النخاع الشوكي (العدد-50) والدم (العدد-50) والمسحات المهبلية (العدد-20) من المرضى الراقدين في مستشفيات مدينة الموصل(مستشفى ابن سينا ومستشفى الخنساء ومستشفى ابن الاثير ) للفترة من كانون الأول 2021 حتى نيسان 2022. تمكنت الطرق التقليدية لعزل وتشخيص البكتيريا من سائل النخاع الشوكي والدم من عزل البكتيريا في 50/5 (10/) و50/2 (4/) من العينات على التوالي. لغرض التش خيص الجزيئي للبكتريا المتواجدة في عينات سائل النخاع الشوكي وعينات الدم؛ تم اس تخلاص الحمض النووي مباشرة من العينات المذكورة؛ ثم تم تضخيم جين rRNA 165 الخاص بهم بواسطة تقنية ال PCR باستخدام البادئات 27F و181522. تم اعتماد نتيجة إيجابية عندما كشف عن الحزمة ذات الحجم 1495 زوج قاعدة على هلام الاكاروز. من المثير للاهتمام؛ أن النتائج التي تم الحصول عليها من التشخيص الجزيئي أظهرت أن 33 و 7 (66/ , 754( من سائل النخاع الشوكي وعينات pall ضخمت الجين ،16S rRNA مما يشير إلى وجود البكتيريا المسببة للأمراض. تم إرسال العينات الإيجابية الى الشركة المتخذصصة بتحديد تساسلات الحمض النووي وتمت مقارنة تسلس لها مع نظائرها المقدمة إلى NCBI لغرض التعرف على نوع البكتيريا. أظهرت النتائج أن 28 من أصل 45 عينة س لبية تم الحمصول عليها من الطرق التقليدية، ان 2 من Glue النخاع الشوكي تحتوي بالفعل على مسببات الأمراض البكتيرية والتي تم الكشف عنها بالطرق الجزيئية. أظهر تحليل تسلسل الجين rRNA 165 أن البكتيريا المكتشفة تنتمي إلى ستة أجناس مختلفة بمافي ذلك: Lactobacillus و Janibacter sPseudomonas sPlanococcus و Achromobacter Bacteroides اكتشفت دراستنا لأول مرة alle تواجد Planococcus و 70711800167في عينات سائل النخاع الشوكي وان عدم عزلهم بالطرق التقليدية قد يعود الى المتطلبات الخاصة لعزلهم والتي لا تتوفر بالطرق التقليدية. من ناحية أخرىء؛ فإن 25 من أصل 48 عينة سلبية تم الحصول عليها من الطرق التقليدية من الدم ان (52 /) تحتوي بالفعل على مسببات الأمراض البكتيرية كما تم الكشف عنها بالطرق الجزيئية. أظهر تحليل تسلسل الجين rRNA 169 أن البكتيريا المكتشفة تنتمي إلى تسعة أجناس مختلفة la في ذلك: Lactobacillus و Bacteroides و Pseudomonas و Klebsiella و Citrobacter و Janthinobacterium و Staphylococcus و Enterobacter و Escherichia عرضت مسحات المهبل للطرق التقليدية لغرض عزل البكتيريا والتعرف عليها والتي تضمنت النمو على الوس ائط الانتقائية والغنية، ودراسة خصائص ها الزرعية، بالإضافة إلى الاختبارات الكيموحيوية. أظهرت النتائج أن (20/11) 755 من العينات أنتجت مس تعمرات بكتيرية على الوسط الزرعىء بيذما )20/9( 745 أخفقت فى إنتاج مستعمرات. من ناحية cs Al تم عزل الحمض النووي الجيني مباشرة من نفس 20 عينة مسحة مهبلية واستخدمت لتضخيم جين rRNA 165. كما متوقع اظهرت جميع العينات نتيجة موجبة للفحص الجزيئي وذلك لتواجد الفلورا الطبيعية في عينات مسحات المهبل ولهذا الغرض تم اس تخدام تقنية التهجين الوراثي بحل هذه المشكلة وباس تعمال طريقة كلونة الثايمين-الادنين. حيث تم كلونة نواتج تفاعل البلمرة مع الناقل pGEM-T easy vector من خلال كلونة الثايمين- الادنين ثم حددت التسلسل الوراثي وعينت المسببات المرضية. النتائج لاوضحت بأن جميع العينات ض خمت yall المعني وعند كلونته بالناقل وتحديد تسلسله الوراثي تم تشخيص البكتريا Lactobacillus 75 و Streptococcus pyogenes و Pseudomonas synxantha و Lancefieldello rimae على الرغم من ان هذه الطريقة تتطلب وقت ومهارة الا انها اعطت نتائج ادق لم تتمكن الطرق التقليدية من توفيرها.

Many bacterial pathogens fail for be isolated on cultural media for several reasons including antibiotic administration by patients, slow growth of some pathogens, low number of pathogens in the specimen, or the requirement of special nutrients and cofactors. Accordingly, specimens are miss diagnosed as negative where they might carry some pathogenic microbes. Therefore, developing new strategies for bacterial identification is important to provide better health quality. This study aimed to directly diagnose bacterial pathogens from clinical specimens by amplifying and then sequencing their 16S rRNA gene. Results obtained were compared with traditional methods used in hospitals to diagnose pathogenic microbes and identify the efficiency of molecular methods compared to traditional methods in bacterial identification from clinical specimens. For this reason, a total of 120 samples were collected from cerebrospinal fluid (CSF) (n=50), blood (n=50) and Vaginal and cervical swabs (n=20) from patients hospitalized in Mosul city hospitals (Ibn Sena Hospitals, AL Kansaa Hospital, Ibn Al-Atheer Hospital) for the period from December, 2021 to April, 2022. Traditional methods for bacterial isolation and identification from CSF and blood detected bacterial growth in 5/50 (10%) and 2/50 (4%) of the samples, respectively. For molecular diagnosis of CSF and blood specimens, DNA was extracted directly from the mentioned specimens, then their 16S rRNA gene was amplified by PCR using 16S rRNA universal primers (27F and 1522R). A positive result was recorded when a 1495bp band was detected from running the amplified product across agarose gel. Interestingly, results obtained from molecular diagnosis showed that 33 (66%) and 27 (54%) of CSF and blood specimens amplified the corresponding gene for 16S rRNA, suggesting the presence of pathogenic bacteria. The positive samples that amplified 16S rRNA gene were sent for DNA sequencing and their sequences were compared to counterparts submitted to National Center Biotechnology Information for the purpose of bacterial identification. The results showed that 28 out of 45 negative specimens obtained from traditional identification method from Cerebral spinal fluid (62.2%) did actually contain bacterial pathogens as detected by molecular methods. Analysis of the 16S rRNA gene sequences showed that the bacteria detected belonged to six diffrent genera including: Lactobacillus, Planococcus, Pseudomonas, Janibacter, Bacteroides and Achromobacter. Our study detected for the first time worldwide the presence of Planococcus and Janibacter in CSF speciemns. This could be due to the special requirments for their isolation that are not provided in traditional methods. On the other hand, 25 out of 48 negaitive specimens obtained from traditional identification method from blood (52%) did actually contain bacterial pathogens as detected by molecular methods. Analysis of the 16S rRNA gene sequences showed that the bacteria detected belonged to nine different genera including: Lactobacillus, Bacteroides, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Janthinobacterium, Staphylococcus, Enterobacter, and Escherichia. Swabs were exposed to traditional methods for bacterial isolation and identification which involved growth on selective and rich media, studying their cultural characteristics, in addition to basic biochemical tests. Results showed that (11/20) 55% of the samples produced bacterial colonies on cultural media, while (9/20) 45% failed in producing colonies. On the other hand, genomic DNA was directly isolated from the same 20 Vaginal and cervical swab specimens and was used to amplify 16S rRNA gene. As expected, all the 20 specimens showed a positive result with direct amplification by 16S rRNA primers due to the presence of normal flora in the vaginal samples. Therefore, recombinant DNA technology was used to solve this issue using the Thymine Adenin cloning method. PCR products were cloned to pGEM-T easy vector via Thymine Adenin cloning and sequenced to identify the bacterial pathogens involved. Results showed that all Vaginal and cervical swabs amplified 16S rRNA gene products and when cloned to pGEM-T easy vector and sequenced, the bacteria detected included Lactobacillus iners, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas synxantha, and Lancefieldello rimae. This method requires more time and skills, nevertheless gives highly accurate results that traditional methods of isolation and identification do not provide.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب