كفاءة وسط HiCrome Acinetobacter Agar في تشخيص بكتريا Acinetobacter baumannii من مصادر سريرية ودراسة خصائص بلازميداتها

الباحث

نسرين عبدالله فتحي محمود النعيمي

المشرف

ريان مازن فيصل العبيدي

الجامعة

جامعة الموصل

الكلية / القسم

كلية العلوم / قسم علوم الحياة

الشهادة

ماجستير

السنة

2024

لغة الرسالة

انكليزي

الكلمات المفتاحية

Acinetobacter baumannii ; HiCrome Agar ; Plasmids ; Clinical Isolates

تم جمع مائة وسبعين عينة من مستشفيات الموصل/ العراق. وشملت العينات 9034.1 حروق، 4 ادرار، 9022.3 جروح، 011.7 قشع؛ و9,04.1 عينات للسائل الدماغي الشوكي. من بين 170 Aue 90 عينة اظهرت نموًا على Acinetobacter Agar ©111)1010. بكتريا Acinetobacter baumannii على HiCrome Acinetobacter Agar يجب أن تظهر على شكل مستعمرات صفراء إلى بنفسجية فاتحة بينما تمنع جميع أنواع البكتيريا الأخرى. إلا أن الدراسة الحالية أظهرت أن المستعمرات ظهرت مستديرة ومخاطية واختلفت في لونها. ظهرت معظم المستعمرات باللون البنفسجي (35 بنفسجي فاتح و 51 بنفسجي داكن قليلاً)، أما الأربع عزلات المتبقية فكانت 3 بيضاء وواحدة صفراءء مما يشير إلى أن 9096.6 من العزلات تنتمي إلى A. baumannii aly Ll يتم ذكر الفرق في لون المستعمرة في التعليمات المقدمة من شركة Himedia بخصوص HiCrome Acinetobacter Agar ولذلك تم إخضاع المزيد من التعريف للتعرف على العزلات التي تم الحصول عليها. أظهر الفحص المجهري للعزلات أن جميع العزلات كانت سلبية لصبغة cal pS إلا أن الفحص المجهري حدد المستعمرات البيضاء بأنها Candida spp يُعتقد أن نمو المستعمرات البيضاء على HiCrome Acinetobacter Agar يرجع إلى عدم فعالية المضادات الحيوية البكتيرية في الوسط تجاه Candida spp بالإضافة إلى عدم وجود مضادات الفطريات الأخرى. تم بعد ذلك إخضاع المستعمرات لاختبار الأكسيدازء مع العلم أن A. baumannii سلبيه تجاه الأكسيداز. أظهرت النتائج أن 35 مستعمرة بنفسجيه فاتحة كانت سلبية تجاه الأكسيداز، بينما كانت 51 مستعمرة بنفسجيه داكنة قليلاً إيجابية تجاه الأكسيداز. من ناحية أخرىء كانت المستعمرة ذات اللون الأصفر الفاتح أيضًا سلبية للأكسيداز. أدى استخدام أوكسيديز إلى خفض معدل عزل A. baumannii من 9095.5 إلى 9038.9. وهذا تراجع كبير بالنسبة لأجار HiCrome Acinetobacter عند استخدامه بمفرده للتعرف على A. baumanni للتمييز بين baumannii .لم ومخمرات اللاكتوز التي تنتمي إلى البكتيريا المعوية Cucd centerobacteriaceae زراعة جميع البكتيريا المعزولة على أجار ماكونكي. أظهرت النتائج أن العزلة الصفراء الفاتحة المفردة كانت غير متخمرة للاكتوز وأن جميع المستعمرات ال 51 ذات اللون البنفسجي الداكن كانت غير متخمرة للاكتوز أيضًا. بالإضافة إلى Ald كانت جميع المستعمرات ال 51 ذات اللون البنفسجي الداكن منتجة للبيوسيانين، مما يشير إلى أنها تنتمي إلى بكتيريا . Pseudomonas. 65 ونتيجة لذلكء فمن المعقول تحديد P. aeruginosa على أجار HiCrome 17 لأنه يقاوم معظم المضادات الحيوية المضافة في الوسط (الأمبيسيلين والسيفتازيدين) لاختيار A. baumannii. ومن المثير للاهتمام أن العزلات السلبية للأكسيداز ذات اللون البنفسجي الفاتح والبالغ عددها 35 عزلة اختلفت أيضًا في قدرتها على تخمير اللاكتوز. أظهرت نتائجنا ان 23/35 ( 65.7% ) كانت مخمرة للاكتوز. أدى انخفاض معدل العزل إلى 914.4 عند استخدام أجار ماكونكي كفحص ثانيي لتحديد النوع. a سلس نتائج التعرف الجزيئي بواسطة تسلسلات 16SPRNA من العزلات المختارة؛ أظهرت أن 11 عزلة بنفسجية فاتحة (سلبية أوكسيديزء غير مخمرة للاكتوز) ومستعمرة صفراء فاتحة واحدة (سلبية أوكسيديزء غيرمخمرة للاكتوز) تم تحديدها على أنها baumannii .4، في حين تم تحديد مستعمرة واحدة (سلبية أوكسيديزء غيرمخمرة اللاكتوز). تم تحديدها على أنها Morganella morganii 5 هذا يقلل من معدل العزل إلى 9013.3 ويظهر أن SRNA 16 فقط قد يوفر تحديدًا دقيقًا ل A. baumannii ومع ذلكء تم العثور على 23 مستعمرة بنفسجيه فاتحة تم اكتشافها على HiCrome Lal 01617 وهي معزولة من غير Acinetobacter كانت هذه المستعمرات Lig) سلبية للأكسيداز ولكن مخمره للاكتوز المخمر. كشف SRNA 16 أن هذه المستعمرات تنتمي إلى أنواع البكتيريا المعوية بمافي ذلك Esherichia coli, Enterobacter spp., و Klebsiella 4 ر علاوة على ذلك، أظهر تشخيص المستعمرات البنفسجية الداكنة Hall بواسطة تسلسل (56.7%) التي لديها نسبة عزل أعلى P. aeruginosa أن هذه العزلات تنتمي إلى 165 rRNA كوسيلة HiCrome Acinetobacter يشير هذا إلى أنه يمكن استخدام أجار A. baumannii مقارنة ب من المصادر السريرية. 2. aeruginosa انتقائية وتفاضلية لعزل تم اختبار مقاومة عزلات baumannii .4 للمضادات الحيوية ل 12 Logs Ilias أظهرت النتائج أن %100 من عزلات baumannii .4 كانت مقاومة للأدوية المتعددة (MDR) من أجل دراسة الجينات الموجودة على بلازميدات cA. baumannii تم إجراء التحول الجيني. نجحت طريقة الصدمة الحرارية في تحويل E.coli DH5a بالبلازميدات من GW Rs .كل gal Les ،baumannii إلى نقل المقاومة إلى سبعة مضادات حيوية من أصل 11 تم اختبارها في تجربة التحول. أظهرت المستعمرات المحولة قيم MIC متطابقة مع نظيراتها من النوع البريء باستثناء الأميكاسين، حيث كان coli DH50, Gal .1 المحولة MIC أقل. يشير هذا إلى وجود آليات إضافية في 1 المء تتجاوز جينات المقاومة التي تحملها cape DUI مما يساهم في مقاومة الأميكاسين. أظهرت جميع المستعمرات المتحولة أنماط مقاومة موحدة للمضادات الحيوية، مما يشير إلى أن المقاومة نشأت من بلازميد واحد. تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد سبعة جينات مقاومة للمضادات الحيوية بوساطة البلازميد في جينوم baumannii .4. لم يتم العثور على جينات مقاومة الكينولون cqnrB <qnrA) و0775) والكوليستين (mcr-1) ومع ،Ala حملت جميع العزلات جين ('aac6) الذي يمنح مقاومه الكينولونات، وخاصة السيبروفلوكساسين. ووجدت الدراسة أيضًا أن جميع عزلات A. baumannii تحتوي على جينات ،folds blaoya-5; التي تشفر كاربابينيماز من نوع OXA ومقاومة تريميثوبريم، على التوالي.

One hundred and seventy specimens have been collected from Mosul Hospitals/ Iraq. The specimens included 34.1% burns, 29.4% urine, 22.3% wounds, 11.7% sputum, and 4.1% CSF samples. Out of 170 samples, 90 samples produced growth on HiCrome Acinetobacter Agar. Acinetobacter baumannii on HiCrome Acinetobacter Agar should appear as yellow to light purple colonies while inhibiting all other types of bacteria. However, the current study shows that colonies have appeared round and mucous and differed in their color. Most of the colonies appeared purple (35 light purple and 51 slightly darker purple), the remaining four isolates are 3 white and 1 yellow, indicating that 96.6% of the isolates belong to A. baumannii The difference in colony color was not mentioned in the instructions provided by Himedia for HiCrome Acinetobacter Agar. Therefore, further identification is subjected to identify the isolates obtained. Microscopic examination of isolates reveals all isolates are Gram-negative, but white colonies are identified as Candida spp. The growth of these colonies on HiCrome Acinetobacter Agar is believed to be due to ineffective antibiotics and lack of antifungals. Colonies were subjected to oxidase test, knowing that A. baumannii is negative towards oxidase. The results showed that the 35 light purple colonies were negative, while the 51 slightly darker purple colonies, were positive towards oxidase. On the other hand, the light yellow colony was also oxidase negative. Using oxidase has reduced the isolation rate for A. baumannii from 96.6% to 40 %. This is a huge drawback for HiCrome Acinetobacter Agar when used alone to identify A. baumannii. To differentiate A. baumannii from lactose fermenters belonging to enterobacteriaceae, all isolated bacteria were grown on MacConkey agar. The results showed that the single light yellow isolate and the 51 slightly purple colonies were all non-lactose fermenters. In addition all 51 slightly purple colonies are pyocyanin producers suggesting that they belong to Pseudomonas aeruginosa. As a result, it is reasonable to select P. aeruginosa on HiCrome Acinetobacter Agar as it resists the antibiotics added in the medium for selection of A. baumannii. Interestingly, the 35 light purple oxidase negative isolates also differed in their ability to ferment lactose. Our results have showed that 23/35 (65.7%) were lactose fermenters. Excluding these isolates from our previous isolation percentage decreased the isolation rate to 14.4% when MacConkey agar is used as a second layer for identification. The results from molecular identification using 16S rRNA sequencing showed that 11 light purple (oxidase negative, non-lactose fermenters) and the single light yellow colony (oxidase negative, non-lactose fermenter) were identified as A. baumannii, while one colony (oxidase negative and non-lactose fermenter) has been identified as Morganella morganii. This reduces the isolation rate to 13.3% and shows that only 16S rRNA gene sequencing may provide accurate identification for A. baumannii. However, the 23 light purple colonies detected on HiCrome Acinetobacter Agar were found to be non- Acinetobacter isolates. These colonies are also oxidase negative but fermented lactose. 16S rRNA sequencing for some representatives revealed that these colonies belonged to enterobacteriaceae species including Esherichia coli, Enterobacter spp., and Klebsiella pneumoniae. Furthermore, diagnosis of the slightly dark purple colonies by 16S rRNA sequencing showed that these isolates belonged to P. aeruginosa which has a higher isolation rate (56.7%) compared to A. baumannii. This suggests that HiCrome Acinetobacter Agar could be used as a selective and differential media for the isolation of P. aeruginosa from clinical specimens. Antibiotic resistance of the A. baumannii isolates have been tested for the resistance to 12 antibiotics. The results have showed that 100% of A. baumannii isolates are multi-drug resistant (MDR). In order to study the genes located on A. baumannii plasmids, genetic transformation has been conducted. The heat- shock method successfully transformed E. coli DH5α with plasmids from A. baumannii strains, transferring the resistance to seven antibiotics out of 11 tested in the transformation experiment. The transformed colonies showed identical MIC values to their wild type counterparts, except for amikacin, where the transformed E. coli DH5α had a lower MIC. This suggests additional mechanisms in A. baumannii, beyond plasmid-borne resistance genes, contributing to amikacin resistance. All transformed colonies have exhibited uniform antibiotic resistance patterns, indicating that resistance has been originated from a single plasmid. PCR used to identify seven plasmid-mediated antibiotic resistance genes in the genome of A. baumannii. No quinolone (qnrA, qnrB, and qnrS) and colistin (mcr-1) resistance genes have been found. However, all isolates carried aac(6') gene which can modify the effect of quinolones, particularly ciprofloxacin. The study also finds that all A. baumannii isolates, contained the blaOXA-51 and folA genes, which encodes OXA-type carbapenemase and trimethoprime resistance, respectively.

طلب نسخة من الملف

الملفات غير منشورة على الموقع. اترك بياناتك وسيتواصل معك موظفو قسم الشؤون الثقافية والفنون لإرسال النسخة مجاناً.

الاسم

رقم الهاتف

البريد الإلكتروني

الغرض من الطلب (اختياري)

إرسال الطلب